迴圈腫瘤DNA的檢測應用介紹

　　迴圈腫瘤DNA（ctDNA）的生物學特性 

　　在生理或病理狀態下，細胞壞死或凋亡時細胞核內或線粒體內DNA會釋放到血液、胸腔積液、腦脊液、尿液和痰液等體液中。迴圈游離DNA(cfDNA)是細胞外DNA降解産物，片段大小約150～200bp。人的cfDNA濃度多低於100μg/L，平均約30μg/L;中晚期腫瘤患者cfDNA濃度可高達1000μg/L，平均約180μg/L。

　　迴圈腫瘤DNA(ctDNA)作為cfDNA的一類，來源於腫瘤細胞，主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，可反映腫瘤的異質性，目前關於ctDNA釋放的確切機制尚不明確。健康人體中ctDNA的水準很低，而在腫瘤患者體內可檢測到更高水準的ctDNA，且腫瘤患者體內的ctDNA比例與腫瘤負荷呈正相關。ctDNA在cfDNA中的佔比較低，中晚期腫瘤患者ctDNA佔cfDNA的比例約為8%～10%，在腫瘤早期或治療緩解後可低至0.01%～1.7%。血液中ctDNA半衰期為15分鐘至數小時。

　　ctDNA的水準可反映患者體內腫瘤的全景數據，全面反映與腫瘤組織相同的突變基因組信息，包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數異常以及甲基化等相關突變信息。

　　迴圈腫瘤DNA（ctDNA）的研究進展 

　　在ctDNA研究中，常用的檢測技術包括突變擴增阻滯系統(ARMS)、數字PCR(dPCR)及新一代測序(NGS)等，各方法的檢測原理、靈敏度、特異性和通量各不相同。低豐度ctDNA對檢測技術的靈敏度要求很高。對於ARMS和dPCR，不同方法間的檢測差異與樣本處理、提取效率、引物位置和探針修飾等有關。對於NGS，其檢測靈敏度除與樣本處理有關外，還與每一步反應效率和測序深度有關。

　　研究表明，通過檢測ctDNA，可獲得腫瘤的相關蹤跡信息，ctDNA在腫瘤篩查、早診診斷、微小殘留病灶和復發監測、療效評價、指導靶向藥物使用及生存評估等各方面均具有一定的臨床應用前景。

　　迴圈腫瘤DNA（ctDNA）檢測尚存在的問題 

　　目前，ctDNA檢測仍面臨諸多問題。首先，針對不同種類及不同時期的腫瘤，尚無樣本採集、ctDNA提取以及擴增的標準流程。其次，體液中ctDNA會被巨噬細胞實時清除，從而導致體液中ctDNA含量極低，但目前大多數ctDNA研究集中于具有相對高濃度ctDNA的晚期癌症，缺乏早期癌症和低濃度ctDNA的詳細經驗。

　　另外，ctDNA檢測會出現一定程度的假陰性和假陽性，主要原因是腫瘤的異質性，即原發腫瘤、轉移性腫瘤、ctDNA三者之間存在差異。而且，由於腫瘤組織和ctDNA檢測標準不一致，不同研究給出的一致性數據差異很大。此外，目前ctDNA尚處於小範圍研究，不同研究文獻得到的結果存在差異，需要進行大量的實驗、詳細的數據分析，方可證明ctDNA作為腫瘤臨床生物標誌物的可靠性。

　　迴圈腫瘤DNA（ctDNA）檢測試劑批准概況及審評思考 

　　境內外迴圈腫瘤DNA（ctDNA）檢測試劑批准概況 

　　目前，境內外已批准上市的迴圈腫瘤DNA檢測試劑主要分為兩大類。一類是檢測血漿等體液中特定基因的甲基化，用於特定腫瘤的輔助診斷或篩查。例如，NMPA和FDA已相繼批准了血漿SEPT9基因甲基化檢測試劑，用於特定人群結直腸癌的輔助診斷。目前，NMPA批准了肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測，用於肺癌的輔助診斷等。而且，已批准的ctDNA甲基化檢測試劑，均基於熒光定量PCR方法，該方法的檢測靈敏度有限。

　　另一類是檢測血漿中特定基因的突變情況，用於特定藥物的伴隨診斷。例如，FDA和NMPA相繼批准了血漿中EGFR基因的突變檢測，用於奧希替尼等的伴隨診斷，上述方法均基於熒光定量PCR方法。此外，FDA于2020年批准了GuardantHealth的Guardant360CDx血漿ctDNA檢測試劑，用於識別表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者，這些患者可能會受益於奧西替尼的治療。這是FDA批准的首個將NGS和液體活檢技術結合，指導臨床治療決策的診斷檢測。

　　對迴圈腫瘤DNA檢測試劑的審評思考 

　　·針對伴隨診斷用途，關注血漿迴圈腫瘤DNA（ctDNA）檢測的適用性

　　研究表明，血漿ctDNA中基因突變檢測結果與腫瘤組織中的基因突變檢測結果存在較大差異，因此，腫瘤組織基因檢測依然是目前腫瘤靶向治療的公認標準。NMPA批准的吉非替尼説明書要求，晚期非小細胞患者治療前應檢測組織EGFR突變，但腫瘤組織不可評估，則可檢測血液標本中ctDNA並評估，以鑒別出最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》也提出，當腫瘤組織難以獲取時，可將血液EGFR基因突變檢測作為合適的替代，作為對可疑組織檢測結果的補充。此外，NMPA批准的ctDNA伴隨診斷試劑也強調了上述要求。

　　研究表明，針對不同癌種，血漿ctDNA腫瘤基因突變檢測與腫瘤組織基因突變檢測的一致性存在較大差異，對於那些檢測結果差異較大的癌種，應綜合考慮臨床應用風險，慎重考慮血漿ctDNA檢測試劑作為伴隨診斷試劑的可行性，哪些腫瘤患者血漿ctDNA可作為組織基因檢測的替代需深入研究，不可盲目申報。

　　·針對用於輔助診斷的DNA甲基化檢測試劑，關注迴圈腫瘤DNA（ctDNA）檢測的臨床意義

　　應關注特定甲基化基因的臨床使用價值。腫瘤基因甲基化研究是目前的熱點，針對不同癌種，往往出現多種不同的甲基化基因。在考慮某個甲基化基因是否具有臨床轉化應用價值時，建議全面調研該甲基化基因的所有相關臨床研究資料，系統評價相關臨床研究設計是否科學、病例是否充分，得出的結論是否科學可信。在腫瘤發展早期，體液中的迴圈腫瘤DNA含量較低，甲基化檢測的靈敏度較低，可能導致無法滿足臨床使用需求。

　　儘管研究表明ctDNA檢測在腫瘤診療領域顯示出良好的應用前景，但其仍存在諸多待研究的問題，包括樣本處理、檢測的標準化、靈敏度、特異性、陽性預測值和臨床適用性等。2018年，美國臨床腫瘤學會（ASCO）和病理學家協會（CAP）發表了聯合評估:目前，ctDNA在腫瘤早期診斷、微小病變殘留檢測以及療效監測的有效性和實用性證據依然不足，除了經過法規審批的經嚴格驗證的ctDNA檢測可用於指導靶向治療外，大多數ctDNA檢測尚需大量實驗結果和臨床試驗的支撐，現階段不宜在臨床廣泛開展，後續研究應盡可能納入預期適用人群，通過嚴格設計的臨床研究來充分驗證其臨床意義。

　　（作者：劉容枝    作者單位：國家藥監局醫療器械技術審評中心）